--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱： HL-60(人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞)

細(xì)胞別稱： HL 60; HL60

細(xì)胞貨號： SNL-040

生長特性： 懸浮

培養(yǎng)條件： 1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細(xì)胞簡介： HL-60細(xì)胞是源自一位患有急性粒-單核細(xì)胞白血病的36歲白人女性的早幼粒細(xì)胞系。HL-60細(xì)胞自發(fā)分化，丁酸鹽、次黃嘌呤、佛波醇、肉豆蔻酸、DMSO(1%-1.5%)、放線菌素D和視黃酸均可以促進(jìn)分化。HL-60細(xì)胞表現(xiàn)出吞噬活性，并對趨化刺激有響應(yīng)；HL-60細(xì)胞致癌基因myc表達(dá)陽性。該細(xì)胞系可用于免疫紊亂和免疫學(xué)研究。

細(xì)胞正常生長形態(tài)照片

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

l HL-60細(xì)胞懸浮圓形生長，偶有小聚團(tuán)，屬于正?，F(xiàn)象，無需吹散；

l 少量細(xì)胞附著瓶底屬于正?，F(xiàn)象，可將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新瓶，丟棄貼壁的細(xì)胞；

l 圓形透亮、細(xì)胞膜完整的細(xì)胞是活細(xì)胞，如果無法判斷，可以取少量細(xì)胞用臺盼藍(lán)染色后計數(shù)確定細(xì)胞活率；

l 接種密度建議在10萬-50萬細(xì)胞/mL之間為宜，密度過低或過高都可能造成細(xì)胞狀態(tài)變差；

l 復(fù)蘇時需盡快離心去除DMSO，避免DMSO刺激HL-60細(xì)胞發(fā)生分化；

l HL-60細(xì)胞生長需要穩(wěn)定的環(huán)境，不頻繁拿出培養(yǎng)箱，不頻繁離心；

l 當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)較差時，不建議對細(xì)胞進(jìn)行離心，需換液時可采用半換液法（詳細(xì)步驟見下文）

HL-60細(xì)胞換液方法

l 半換液法：

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）

2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時間，待細(xì)胞沉底；（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況）

3. 小心吸出一半的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到離心管；

4. 900-1000rpm 3min離心，離心管里若有細(xì)胞，則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶；

5. 原瓶補(bǔ)充一半的新鮮培養(yǎng)基，混勻細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

l 離心換液法：

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）

2. 將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；

3. 900-1000rpm，3min離心；

4. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

5. 離心完成后棄上清，加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中，混勻細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

HL-60細(xì)胞傳代方法

l 離心法：

1.取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確定細(xì)胞密度，密度80萬/mL以上傳代，并根據(jù)計數(shù)結(jié)果確定傳代比例；

2.準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）

3.用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；

4.900-1000rpm，3min離心收集細(xì)胞；

5.在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

6.離心完成后，棄離心管內(nèi)上清，然后加入適量新鮮培養(yǎng)基，輕輕重懸吹散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips：懸浮細(xì)胞通常都偏脆弱，注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉(zhuǎn)速以及時間不要過高，避免細(xì)胞受機(jī)械損傷。

l 直接分瓶法：

1. 取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確定細(xì)胞密度，密度80萬/mL以上傳代，并根據(jù)計數(shù)結(jié)果確定傳代比例；

2. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分散；

3. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液，均分到若干個新培養(yǎng)瓶中，每瓶再補(bǔ)充適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips：用直接分瓶法傳代1-2次后需進(jìn)行離心傳代。

HL-60細(xì)胞凍存方法

1. 取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確認(rèn)細(xì)胞密度。

Tips：若凍存前培養(yǎng)基已經(jīng)變黃，先換液靜置培養(yǎng)4h左右，待細(xì)胞活力穩(wěn)定后再進(jìn)行凍存。

2. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、PBS、血清、DMSO、離心管以及無菌槍頭等；（試劑需提前預(yù)熱）

3. 根據(jù)收集到細(xì)胞量，配制相應(yīng)量的凍存液，并準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的凍存管，在凍存管上標(biāo)志細(xì)胞名稱，代次，凍存時間等信息。推薦凍存液配方：92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO；凍存密度200-300萬細(xì)胞/mL/管。

Tips：凍存密度過低將導(dǎo)致復(fù)蘇后狀態(tài)不佳。

4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm，3min離心收集細(xì)胞；

5. 離心完成后棄上清，加入相應(yīng)量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度，不要產(chǎn)生過多氣泡；

Tips：加入凍存液混勻細(xì)胞后及時分裝并將細(xì)胞降溫凍存，以減少DMSO對細(xì)胞的毒性。

6. 將細(xì)胞放置程序降溫凍存盒中，再將凍存盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行降溫凍存。

7. 次日復(fù)蘇一管檢查凍存效果，確認(rèn)沒問題后及時將凍存細(xì)胞放置液氮中保存，細(xì)胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。

HL-60細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；

2. 將凍存細(xì)胞從液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速搖晃至完*融化，融化時間1min左右；

3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心，同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；

4. 離心完成后棄上清，吸取1mL新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，吹散細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中；

5. 使用十字法或8字法將細(xì)胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Tips：

1. 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運送至細(xì)胞房。

2. 細(xì)胞融化后需盡快離心去除DMSO，避免DMSO刺激HL-60細(xì)胞發(fā)生分化。

3. 整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

HL-60細(xì)胞收貨攻略

1. 拆封包裝盒，確認(rèn)細(xì)胞，說明書等是否齊全，收貨細(xì)胞名與所購買細(xì)胞是否符合；

2. 觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好，有無漏液，培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等，發(fā)現(xiàn)異常及時拍照聯(lián)系銷售人員；

3. 確認(rèn)無異常后，將培養(yǎng)瓶表面消毒，然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右，讓懸浮細(xì)胞沉下培養(yǎng)瓶底部；

4. 平衡過程中可以仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，知悉細(xì)胞所需培養(yǎng)體系，培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項等；

5. 平衡完成后豎立取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，此時大部分細(xì)胞沉在培養(yǎng)瓶底部，小心吸取上清至離心管中，保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi)，小心操作，盡量不要吸到沉在底部的細(xì)胞；

6. 將離心管1200rpm，5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞，上清可以4℃保存，后續(xù)用于培養(yǎng)細(xì)胞，以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細(xì)胞接種至原培養(yǎng)瓶；

7. 輕輕混勻細(xì)胞，取100-200ul細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)密度。然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

常見問題及解決方案

1.細(xì)胞密度怎么計算的？

嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而計數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可通過900-1000rpm，3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細(xì)胞生長，不建議頻繁離心。

產(chǎn)品推薦：

【SNL-040】 HL-60(人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞)(STR鑒定正確)

【SNLM-040】HL-60細(xì)胞專用完*培養(yǎng)基